PCR (Polymerase chain Reaction)
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PCR의 원리는 세균의 DNA polymerase를 이용하여 시험관내에서 DNA의 구성요소인 4개의 단일 deoxyribonucleoside triphosphate들을 sugar-phosphate bond (phosphodiester bond)로 결합시켜 새로운 DNA double helix를 형성하는 것이다. DNA polymerase가 새로운 DNA를 합성하기 위해서는 복제대상인 single-stranded DNA가 이미 존재해야 한다. 이 single-stranded DNA는 DNA polymerase가 새로운 DNA를 합성하기 위한 template로서 역할을 하며 삽입되는 염기는 반드시 5'-triphosphate(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)로 있어야 한다. 그러나 DNA polymerase는 single-stranded DNA template와 4개의 dNTP만을 갖고 DNA 합성을 시작할 수 없는데 이는 primer라는 short piece of single-stranded DNA가 이미 DNA-template에 base pairing이 되어 있어야 부분적인 double-stranded DNA 형태를 DNA polymerase가 인지하여 5' → 3'방향으로 template와 pairing 되게 DNA 사슬을 만들게 되는 것이다. 생체내의 DNA 복제 시 사용되는 primer는 RNA인 반면 시험관내에 사용되는 primer는 DNA oligonucleotide이다. DNA polymerase는 RNA-DNA pairing이나 DNA-DNA pairing 모두 인지하여 DNA 합성을 시작한다(Fig1). 종합적으로 말해 DNA polymerase는 이미 존재하는 single-stranded DNA template에 결합된 DNA 또는 RNA oligonucleotide의 3'-end에 template에 상응하는 새로운 염기를 채워 double-stranded DNA로 만드는 역할만 할 수 있다는 것이다.
PCR amplification은
1) double- or single-stranded DNA template,
2) DNA polymerase,
3) 증폭을 목적하는 DNA sequence의 양끝에 상응하는 18-22 염기의 synthetic short oligonucleotide,
4) 4개의 dNTPs, 5) DNA polymerase가 작용할 수 있는 buffer 조건을 갖추어야 한다.
(Fig2.)위 조건을 갖춘 시험관의 온도를 94oC까지 2-3분간 올려주면 double-stranded DNA template는 single-stranded DNA로 분리하게 되고(denaturation), oligonucleotide primer가 DNA template에 결합하기 위한 적정온도(20 염기일 경우 A+T 50%, G+C 50%이면 약 60oC)로 급속히 내려 1분 정도 유지시키면 primer가 자신의 염기서열과 상응하는 부위에 결합하게 된다(annealing). 다시 DNA polymerase(주로 Taq DNA polymerase)의 활동적온인 72oC로 급격히 올려 1분 정도 유지시키면 primer의 3'-end부터 DNA 합성을 시작하여 double-stranded deoxyriboneucleo acid를 만들게 되는 것이다(amplification). 1번의 denaturation-annealing-amplification으로 1개의 DNA double strand(또는 DNA duplex)를 template로 하여 원하는 증폭부위의 DNA duplex를 2개로 증폭되며 다시 한번의 cycle을 반복하게 되면 2개가 4개로 증폭되는 것이 바로 PCR amplification의 결과이다. 따라서 증폭되는 DNA duplex의 수는 2n으로서 25 cycle의 PCR을 하면 225 = 3.4 x 107 DNA를 얻을 수 있게 되는 것이다. 이와 같은 PCR 반응조건에서 보듯이 DNA polymerase는 일반 온도조건에서 생육하는 생명체로 얻을 수 있는 것이 아니라 94oC에서도 안정적인 heat-stable DNA polymerase여야 한다. 다행히도 화산지역의 온천같이 끓는 물에서 서식하는 세균들이 이미 발견되었고 생육적정온도가 72oC인 세균 Thermus aquaticus에서 얻은 Taq DNA polymerase로 이 PCR 반응에 성공적으로 사용될 수 있었다.
* BLAST *
1990년에 Karlin과 Altschul등이 발표한 BLAST(Basic Local alignment Search Tool)는 FASTA 알고리즘과 같이 heuristic을 사용하여 homology를 검색하기 위한 알고리즘으로 여러 가지 면에서 FASTA보다 진보된 방법이다. 알고리즘의 개요는 다음과 같다.
1) 질의 sequence를 분석하여 질의 sequence의 <W-mer>와 score T 이상의 상동성을 가지는 <W-mer>를 모두 생성하여 이를 검색하기 위한 automata를 구성한다(Automata는 연관된 일련의 pattern을 효율적으로 검색하기 위해 일반적으로 사용될 수 있는 기법으로 이 경우 매우 적절한 활용으로 생각됨).
2) 데이터베이스의 각 비교 sequence를 scan하면서 대해 1)에서 구성한 <W-mer>와 일치되는 것이 있는가를 automata를 따라 검사한다. 일치된 W-mer는 local alignment를 위한 seed sequence로 사용된다.
3) 각 seed sequence에 대해 질의 sequence와 비교 sequence의 좌우를 확장해 간다. 확장해 가는 도중 최대치 값보다 일정값 이상 차이가 나는 경우에 확장을 중단하고 이를 MSP(maximal segment pair)로 한다. 이 MSP가 특정 cutoff 값 S 이상이면, 이를 저장한다.
BLAST는 local alignment 만을 처리하며, 특히 gap이 없는 local alignment만을 처리한다(gap을 포함하도록 확장하면 속도가 급격히 떨어지고, 특히 gap을 포함했을 때의 유용성이 별로 없는 것으로 예측되므로 실제 프로그램에서는 gap을 처리하지 않는다). 2)에서 W-mer 검색에서 핵산 sequence의 경우는 비교 sequence들을 4 base 당 하나의 byte로 압축시켜 비교하기 때문에(BLAST 실행을 위한 sequence 데이터베이스가 핵산에 대해서는 압축파일로 구성되어 있다)scan 속도가 더욱 빨라진다. Sensitivity에 영향을 주는 주요 parameter는 W와 T 값이다. 즉, 동일한 W에 대해 T가 작을 수롤 automata를 이루는 W-mer의 list가 커지게 되고, 결과적으로 sensitivity는 증가하지만, 실행시간은 비례적으로 증가한다.
Karlin 등은 데이터베이스가 특정 composition을 가질 경우에, 특정 score를 가진 sequence segment가 N개 나타날 확률을 구하는 방법을 공식화하였다. 따라서, BLAST에서 cutoff score S 이상을 가지는 MSP가 임의로 나타날 수 있는 기대치 E를 구할 수 있으며, 실제로 MSP가 N개 나타났을 경우, random하게 이 MSP가 나타날 확률을 구할 수 있다. 따라서 BLAST 실행에서 S와 E는 동일한 의미를 나타내기 위해 사용되며, BLAST 결과에서 보여주는 확률 값은 검색된 MSP가 검색된 개수만큼 임의로 나타날 수 있는 확률이므로, 그 값이 작을수록 상동성의 중요도(significancy)가 있는 것으로 생각할 수 있다.
BLAST는 여러 개의 프로그램으로 구현되었는데, 단백질 sequence를 PIR이나 SwissProt과 같은 단백질 데이터베이스에 대해 상동성 검색하는 blastp, 핵산 sequence를 GenBank와 같은 핵산 데이터베이스에 대해 상동성 검색하는 blastn, 단백질 sequence를 핵산 데이터베이스에 대해 상동성 검색하는(각 핵산 sequence를 6개의 reading frame으로 translation) tblastn, 핵산 sequence를 단백질 데이터베이스에 대해 상동성 검색하는(핵산 sequence를 6개의 reading frame으로 translation) blastx, 핵산 sequence를 핵산 데이터베이스에 대해 단백질로 변환하여 상동성 검색하는(각 핵산 sequence를 6개의 reading frame으로 translation) tblastx 등이 있다.
Material&Methods
[1st. week]
* materials
→ unknown lysed tissue 2개 (16,34), TB, BW, NW,AE buffer, pipette, 혼합기, tube 2개, spin column 2개, collection tube 4개, centrifuge, 전기영동 장치, gel, 비닐장갑
* methods
▶ 조교 언니가 해주신 부분
→ tissue를 잘라서 1.5㎖ tube에 넣어둔다.
→ TL buffer를 200㎕을 tube에 넣고 vortexing 시킨다.
→ proteinase K solution 20㎕를 넣고 다시 vortexing 시킨다.
→ tissue가 완전히 lysis 될 때까지, 56℃에서 incubate 시킨다.
▶ 우리가 한 부분
→ TB buffer 400㎕를 넣고 바로 vortex시킨 다음 잘 섞어 준다.
→ spin column에 이 mixture를 넣고 1분동안 8000rpm에서 centrifuge를 돌려준다. 그런다음, collection tube를 새로운 것으로 바꿔준다.
→ BW Buffer 700㎕을 넣어준다음 다시 8000rpm에서 1분동안 centrifuge를 돌려준 다음 다시 collection tube를 새것으로 바꿔준다.
→ Buffer NW 500㎕을 넣어주고 13,000rpm에서 3분동안 돌려준다음 spin column을 1.5㎖ tube에 넣어준다.
→ AE buffer를 200㎕넣어주고 상온에서 2분동안 둔 다음, 8000rpm에서 1분동안 다시 centrifuge 해준다.
→ 이렇게 나온 mixture의 4㎕을 EtBr 4㎕ pipetting 하여 섞어서, gel의 well에 잘 넣어준 다음, 전기영동하여 DNA 추출의 여부를 확인한다.
→ 전기영동시 파라필림에 loading dye 1λ를 DNA 4λ와 섞어서 loading 한다.
DNA가 두 종류 였으므로 dye를 각각 0.5λ씩 넣고 DNA 4λ를 넣으면 한 콤에 걸리는 시료의 양은 4.5λ 가 된다.
(주의점 : 4㎕의 EtBr을 섞어줄때 EtBr은 mutagen으로 피부에 닿으면 좋지 않다. 따라서 전기영동시 꼭 비닐장갑을 사용하도록 하고, 쓰고난 비닐 장갑은 버리도록 한다. 그리고 mixture를 loading 할때 gel이 찢어지지 않도록 조심해서 loading 한다.)
[2nd. week]
*materials
→D.W, 10x Buffer, dNTP, Primer(forward, reverse), BSA, Taq. pol, DNA, pipette, 1.5㎖ tube
*methods
▶ 우리가 한 부분
→ reaction factor 형성
tube에 다음과 같은 factor들을 넣어 PCR을 하기 위한 준비를 한다.
|
factor |
vol.(㎕) |
|
D.W |
25.7 |
|
10x Buffer |
4 |
|
dNTP |
0.8 |
|
primer(forward) |
1.6 |
|
primer(reverse) |
1.6 |
|
BSA |
2 |
|
Taq. pol |
0.3 |
|
DNA |
4 |
|
Total |
40 |
[Table.1] reaction factor 구성표
▶ 조교언니가 해주신 부분
→ PCR cycle
cycle을 위한 thermocycle의 condition은 다음과 같다.
|
94℃ (60s) |
94℃ (40s) |
52℃ (60s) |
72℃ (90s) |
72℃ (7min) |
4℃(forever) |
|
|
←-----------35cycle----------→ |
|
|
||
[Table.2] PCR cycler condition
→ PCR product를 확인하기 위해 전기영동을 하여 그 크기와 증폭여부를 확인한다.
[3rd. week]
*materials
→ 전기영동 장치, bluebox, gel, mass, Buffer GB, NW, EB, isopropanol, 혼합기, pipette, spin column, collection tube, 1.5㎖ tube
*methods.
▶ 우리가 한 부분
→ 35λ 이상의 DNA를 전기영동해야 하기 때문에, 홈이 큰 gel을 사용하여 loading dye와 함께 DNA용액을 섞어, well에 loading 한다.
→ 130v에서 40~45분간 전기영동을 시행한다.
→ 시행한 후, blue box 위에 gel을 놓고 PCR product를 확인하여 mass를 사용하여 잘라낸다.
→ gel slice와 PCR product를 분리하기 위한 작업을 하게 한다.
→ 일단, gel의 volume당 3배의 GB Buffer를 tube에 넣어준다. (ex: 0.1g=100㎎ ×3=300㎕)
(16번 tube : 0.09 X 3=270㎕ / 34번 tube : 0.07 X 3= 210㎕)
→ gel slice가 완전히 녹을 때까지 50℃에서 incubate 하고, gel이 녹는 것을 돕기 위해 2~3분마다 vortexing 한다.
( 주의점 :Yellow mixure인지 확인한다. 그 색이 DNA binding을 위한 가장 적합한 Ph상태이다. 만약색이 맞지 않은 상태에서 계속진행하면 membrane을 잘 통과하지 못한다.)
→ isopropanel을 gel slice volume 당 1배를 넣어준다 (0.1g=100㎎ ×1=100㎕)
→ 넣어준 위의 용액을 spin column으로 옮긴다.
→ 1분간 centrifuge를 해준다음, collection tube에 있는 내용물을 버리고 spin column을 내용물이 버려진 collection tube에 다시 꽂는다.
→ NW buffer 700㎕를 넣어주고, 5분동안 둔다.
→ 1분간 centrifuge를 해준다음 다시 collection tube에 있는 내용물을 버리고 spin column을 내용물이 버려진 collection tube에 다시 꽂는다.
→ NW buffer를 300㎕넣어주고, 다시 2분동안 centrifuge를 해주고, spin column을 새로운 1.5 ㎖ tube에 꽂는다.
→ EB buffer나 dH₂O 50㎕를 membrane의 중앙으로 해서 넣어주고 1분 동안 놓아둔 다음 다시 1분동안 centrifuge 하도록 한다.
(주의점 : EB buffer나 dH₂O를 중앙으로 넣어줘야 한다. 워낙에 적은양이라 벽에 묻어나지 않고 바로 DNA에 가해져야하기 때문이다.)
▶조교언니가 해주신 부분
→ DNA sequencing
첫 단계는 DNA를 denature하는 과정이다. NaOH를 써서 변성시킨 후 ethanol로 급격히 침전시키면 denature 상태의 plasmid DNA를 얻을 수 있다.
여기에 sequencing primer를 넣어 annealing 시킨다. Sequencing primer는 위 그림처럼 template가 되는 plasmid DNA에 annealing 할 수 있는 primer를 쓰면 되는데, 대개는 vector의 MCS 양쪽에 있는 부위에 붙을 수 있는 primer를 쓴다. 그러면 insert가 다양해도 단 두 개의 primer만 있으면 모두 양방향으로 sequencing 할 수 있다.
MCS의 양쪽에는 SP6, T3, T7 promoter 처럼 virus origin의 promoter가 달려있는데, 대개는 이 부위에 붙을 수 있는 primer를 합성하여 SP6, T3, T7 primer라고 부fms다. Promoter 중에서 primer의 위치가 전세계적으로 통일되어 염기서열이 같다. 팔기도 한다.
여기서 동위원소와 나머지 dNTP를 넣고 효소를 넣어주면 새로운 DNA 가닥이 합성된다. 이 과정은 새로 합성되는 모든 DNA strand를 동위원소로 표지하기 위한 과정이다. 따라서 반응을 조금 억제해서 너무 길게 합성이 되지 않아야한다. 위와 같이 dNTP를 낮은 농도로 넣고 반응도 상온에서 시행하도록 조건을 맞춘다.
이제 동위원소로 표지된 모든 strand가 dideoxy NTP(ddNTP)에 의해서 반응이 중지되거나 아니거나 하도록 하는 과정을 시행한다. DNA strand가 합성되려면 반드시 3'-OH가 노출되어 있어야 하는데, ddNTP가 들어간 부분은 3'-H 로 되어 있게 되므로 더 이상 합성이 일어나지 않고 끝나게 된다. dNTP가 들어가느냐 ddNTP가 들어가느냐에 따라서 합성이 계속되거나 중지되거나 하는 것이다. 반응의 조건을 맞추면 모든 경우의 수가 다 발생하여 위 그림에서처럼 G로 끝나는 자리에서 ddCTP가 들어가 반응 중지된 모든 strand를 얻을 수 있다.
이처럼 ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP가 들어있는 네 tube에서 각각의 반응을 시행시키면 각 tube에는 특정한 염기서열로 끝나는 모든 종류의 DNA strand가 존재하게 된다. 예를 들어 위 그림에서 ddATP를 넣은 tube에서 반응시키면 tube 속에는 모두 ddATP로 끝난 반응물이 생기게 되며, 이때 그 길이에 해당하는 원래 DNA(template)의 염기 서열은 T임을 알 수 있다.
이를 전기영동한다. 전기영동은 7 M urea가 포함된 8% acrylamide gel에서 한다. 이 gel은 두께가 매우 얇고 acrylamide의 특성상 하나의 염기 차이가 있어도 이동거리가 달라져 크기를 구별할 수 있게 되어 있다. 물론 전기영동시에는 template를 떨어뜨려 denature 상태로 전기영동하여 single strand의 크기 차이로 구별한다. 앞에서 반응시킨 네 개의 tube를 각각 전기영동시키면 위와 같은 그림을 얻을 수 있고 그 염기 서열을 읽을 수가 있게 되는 것이다.
[4th. week]
*materials
→sequencing 한 자료, 컴퓨터
*methods
▶우리가 한 부분
→ ncbi.nlm.nih.gov의 site로 들어가서, 'blast' 라는 menu를 선택한다.
→ 여기서 우리는 DNA sequence를 활용하여 생물을 동정할것이기 때문에 Nucleotide-Nucleotide blast search menu를 선택한다.
→search box에 알고자 하는 생물의 DNA 염기서열을 넣고, blsast!를 클릭하여, 비슷한 organism을 찾는다.
→ 나열되어 질 때에는 유사도가 높은 것부터 나열되어 진다.
6) Results
[1st. week] DNA extraction 전기영동결과
Fig1. DNA extraction 전기영동결과
Fig2. DNA extraction 전기영동결과 (Fig1.편집 후)
=>Fig1.에서는 2조를 제외한 나머지 조들의 band가 희미한 것을 확인할 수 있다.
Fig2.에서는 편집 후 조금더 선명한 band를 확인할수 있고 조별로 밝기의 차이가 나는것은 샘플의 보관상태나 종의 차이 ,실험 technique의 차이 때문일 수도 있고 전기영동 loading시 gel이 새어나오는 등의 문제가 있었을 수도 있다.
marker는 1kb와 100bp를 걸었는데 우리조는 대략 6000bp정도의 크기를 확인할 수가 있었다. 또한 왼쪽에는 16번을 오른쪽에는 34번을 걸었는데 조교언니의 말씀에 의하면 왼쪽 band는 원래 조금만 반짝여야 정상이라고 한다.
모든조가 희미하게 나마 band를 확인할 수있었고 PCR로 증폭시킬 것이기 때문에 적은양으로도 계속 실험이 가능하였다.
[2nd. week] PCR 후 전기영동 결과
Fig3.PCR후 전기영동결과
=>우리조는 16번 band만 선명하고 34번 band는 확인이 되지 않는다.
16번 band의 크기는 대략 800bp정도이다.
[4th. week]
>16
TCTCGTTTAAAGTGAGCTGTCACTTTATTACACTATTATTAATATACGATGACGAGGAATGCAATTTGAGCGTCTTCCTC
TTTTTGTTTGATCTGTTAAAATTACGGCGATTCTCCTTTTACTTTCACTTCCTGTTTTAGCCGGAGCAATTACAATATTG
TTAACTGATCGAAATTTCAATACTGCTTTCTTTGATCCTGCTGGTGGTGGAGATCCTATTTTATACCAACACCTATTTTG
ATTTTTTGGACATCCAGAAGTTTATATTTTGATTTTACCAGGATTTGGAATAATCTCTCACATTGTTAGTCATTATTCTT
CTAAAAAAGAAACTTTTGGAACACTAGGAATGATTTATGCTATATTGGCCATTGGTGTTTTAGGCTTTATTGTTTGAGCT
CATCATATATTTACTGTTGGGATGGACGTAAATACTCGAGCTTATTTTACTGCAGCAACTATGATTATTGCTGTTCCAAC
GGGTATTAAAGTTTTTAGTTGATTGGCAACAATTCATGGTGCAAAAATTAAATATGAAACCCCAATGCTTTGAGCTCTGG
GCTTTATTTTTCTCTTTACTGTTGGGGGTCTTACTGGAATTGTTTTATCTAATTCTTCTTTAGATATTATGCTTCATGAT
ACATACTATGTTGTTGCTCATTTCCACTACGTTTTATCTATAGGAGCTGTTTTCGCCTTATTCGGCTGTGAGAATTTGTA
>34
TCATATTTCAGTATGATGAAACTTTGGGTCTCTTCTAGGACTGTGTCTAATTACACAGATTTTAACAGGACTATTTCTAGCCATACATTACACCTCAGACATCTCAACCGCATTCTCGTCAGTGGCCCACATCTGCCGGGATGTAAATTACGGCTGACTTATTCGAAACCTCCACGCCAATGGAGCATCATTCTTTTTCATTTGTATTTATATACATGTTGCCCGAGGCCTATACTACGGGTCCTACCTCTACAAAGAAACTTGAAACATTGGGGTGGTACTCCTCCTCCTAACAATAATGACAGCCTTCGTTGGCTATGTTCTTCCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGGGCCACAGTAATTACGAACCTCCTATCGGCAGTTCCATACATGGGGGATACTCTAGTTCAATGAATCTGAGGGGGATTCTCAGTAGATAACGCAACACTAACCCGATTCTTCGCATTCCACTTCCTCCTACCATTCATTATTGCCGCCGCAACCCTTCTCCACCTGCTATTCCTGCACGAAACCGGATCAAATAATCCGGCCGGCCTAAATTCAGATGCAGACAAAATCTCCTTCCACCCCTATTTTTCATACAAGGACCTTCTTGGGTTCGTACTAATACTGTTAGCACTAACATCACTAGCACTATTTTCTCCAAATCTGCTGGGAGACCCAGACAATTTTACGCCAGCCAACCCGATGGTTACCCCACCACACATTAAACCAGAGTGATACTTCCTGTTTGCCTACGCCATCCTACGATCTATTCCTAACAAATTGGGAGGTGTCCTTGCATTACTGTTCTCAATTCTCATCCTGATAGTGGTACCAATCCTGCACACTTCGAAGCAACGAGGACTAACATTCCGCCCACTTACTCAATTCTTATTCTGAACCCTGGTGGCAGA
=>http://www.ncbi.nlm.nih.gov
위의 gene bank를 이용하여 실험결과로 나온 DNA sequence를 가지고 그 생물이 속한 집단을 찾아 분류한다.
Sample의 sequence와 유사한 sequence를 가진 생물들 중 가장 유사한 sequence로 상위 2개의 생물을 나열해보았다.
Reference
정해영 外2, 포스트게놈시대의 생물정보학, 월드사이언스, 2002
미노루 가네히사, 포스트 지놈 시대의 생물정보학, 한울, 2001
